В отличие от большинства крупных национальных европейских музеев, Берлинская картинная галерея не была сформирована вокруг бывшей династической королевской коллекции, а создана в результате процесса приобретения картин прусским правительством, начавшегося в 1815 году. С самого начала музей был предназначен для отражения всего спектра европейского искусства. Коллекция организована хронологически, начиная от входа и двигаясь к самой дальней комнате. Посетитель выбирает между южным, в основном итальянским, искусством слева и немецким и фламандским искусством справа.
Здесь постоянно выставлены шедевры всех эпох в истории искусства, в том числе картины Яна Ван Эйка, Питера Брейгеля, Альбрехта Дюрера, Рафаэля, Тициана, Караваджо, Петра Павла Рубенса, Рембрандта и Яна Вермеера. Галерея особенно гордится своей коллекцией немецкой и итальянской живописи XIII-XVI веков и голландской XV-XVII вв. Эти картины демонстрируются в павильоне «Культурфорум» с 1998 года.
Зал произведений Рембрандта занимает центральное место в музее, так как именно здесь собрана самая большая коллекция его произведений, насчитывающая 16 картин. Великолепное собрание итальянской, французской, немецкой и английской живописи XVIII века включает работы Каналетто, Жан-Антуана Ватто, Антуана Песне и Томаса Гейнсборо. В галерее представлено около 3000 шедевров.